Síntese e avaliação de propriedades fotofísicas e biológicas de 2-(2'-hidroxifenil) benzoxazolas e cumarinas em fungos de interesse clínico

Nesta Tese foram avaliadas a síntese e as propriedades fotofísicas e biológicas de cumarinas 4,6,7-substituídas e 2-(2'-hidroxifenil)benzoxazolas 5'-substituídas (5'-HBXs). 2-(2'- Hidroxifenil)benzoxazola e 2-(2'-hidroxi-5'-aminofenil)benzoxazola apresentaram potencial para utilização como fluorocromos em microscopia de epifluorescência de Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428. 6-N-acilaminocumarinas e 2-(2'-hidroxi-5'-aminoacil-fenil)benzoxazolas (Acil = Acetil, succinil) apresentaram potencial para aplicação como substratos fluorogênicos para detecção de atividade amidase por cromatografia em camada delgada em fungos de interesse clínico. 6- Nitrocumarina também apresentou potencial para detecção de atividade nitrorredutase nestes microrganismos. 5'-HBXs (R=H, NH2, AcNH) e 2-fenilbenzoxazola não apresentaram potencial mutagênico sobre as linhagens TA100 de Salmonella typhimurium no ensaio Salmonella/microssoma e sobre a linhagem haplóide XV-185-14c de Saccharomyces cerevisae, sendo a presença do grupo hidroxila na posição 2' considerada um fator protetor para a citotoxicidade celular. A comparação da atividade antifúngica de 5'-HBXs e cumarinas com fenóis e ácidos salicílicos sobre F. pedrosoi ATCC 46428 mostrou que o aumento da complexidade molecular em relação ao grupo fenila altera os parâmetros físico-químicos que relacionam o diâmetro do crescimento micelial radial (CMR) com a concentração dos compostos citados. Os parâmetros fisicoquímicos que melhor se correlacionaram com a atividade antifúngica foram os valores de STERIMOL B1 e B2 do substituinte em fenóis 4-substituídos e a energia de hidratação em ácidos salicílicos 5-substituídos e em cumarinas 4,6,7-substituídas sendo possível propor modelos de correlação com apenas duas variáveis. Com 2-fenilbenzoxazolas os parâmetros selecionados apresentaram baixa correlação. Este comportamento também foi observado quando se tentou obter um modelo único via busca sistemática visando a associação entre as quatro classes de compostos. Por outro lado, foi possível obter modelos de correlação entre CMR e as absorbâncias relacionadas a freqüências dos espectros no infravermelho médio para cada classe de composto separadamente ou para associações destas classes, usando o método dos mínimos quadrados parciais (PLS). Em fenóis e ácidos salicílicos a faixa espectral que melhor correlacionou a atividade antifúngica foi 2000 a 1800 cm-1; em 2-fenilbenzoxazolas foi 1260-1150 cm-1 e 800-700 cm-1 e em cumarinas foi 2000-1800 cm-1 e 900-600 cm-1. Um modelo de associação entre todas as classes foi obtido combinado as regiões de 3150-2850 cm-1, 2050- 1800 cm-1 e 1300-900 cm-1 e o mesmo pode ser descrito com 10 fatores e coeficiente de regressão de validação maior que 0,99. Este método apresentou um maior poder de previsão da atividade antifúngica e mostra-se como uma nova proposta para estudos de correlação quantitativa estrutura atividade biológica com base em espectros de infravermelho de uma série congênere de compostos.In the present study, we assessed the synthesis and photophysical and biological properties of 4,6,7-substituted coumarins and 5'-substituted 2-(2'-hydroxyphenyl)benzoxazoles. 2-(2'- hydroxyphenyl)benzoxazole and 2-(2'-hydroxy-5'-aminophenyl)benzoxazole can be used as fluorochromes in epifluorescence microscopy of Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428. 6-Nacylaminocoumarins and 2-(2'-hydroxy-5'-aminoacylphenyl)benzoxazoles (acyl = acetyl, succinyl) can be utilized as fluorogenic substrates for the detection of amidase activity in fungi of clinical interest, by thin layer chromatography. 6-Nitrocoumarin proved to be useful in detecting nitroreductase activity in these microorganisms. 5'-HBXs (R=H, NH2, AcNH) and 2- phenylbenzoxazole do not demonstrate mutagenic potential on TA100 strains of Salmonella typhimurium in the Salmonella/microsome assay and on the haploid strain XV-185-14c of Saccharomyces cerevisae. In this case, the presence of a hydroxyl group in position 2’ is considered to be a protective factor against cell cytotoxicity. The comparison of the antifungal activity of 5'-HBXs and coumarins with phenols and salicylic acids on F. pedrosoi ATCC 46428 showed that the increase in molecular complexity relative to the phenyl group changes the physicochemical parameters that correlate the diameter of radial mycelial growth with the concentration of the previously mentioned substances. The physicochemical parameters with best correlation with the antifungal activity were STERIMOL B1 and B2 values of the substituent in 4-substituted phenols and the hydration energy in 5-substituted salicylic acids and 4,6,7-substituted coumarins being possible to propose correlation models with only two variables. The parameters selected have demonstrated low correlation with 2- phenylbenzoxazoles. This result was also observed when it was tried to obtain a sole model by systematic screening aiming the association among the four classes of compounds. On the other hand, by using the absorbances related to the frequencies of mean infrared spectra, we were able to obtain correlation models through partial least squares (PLS) for each group of substances alone or for the combination of these groups. The spectral range best correlated with the antifungal activity was 2000-1800 cm-1 at phenols and salicylic acids, 1260-1150 cm-1 and 800- 700 cm-1 at 2-phenylbenzoxazoles and 2000-1800 cm-1 and 900-600 cm-1 at coumarins. An association model among all classes was obtained combining the spectral ranges of 3150-2850 cm-1, 2050-1800 cm-1 and 1300-900 cm-1, and such model can be described with ten factors and validation regression coeficient higher than 0.99. This method presented a higher antifungal activity prevision power and it is shown as a new proposal for quantitative structural-biological activity relationships studies on basis in infrared spectra of a compound congeneric series

Prediction of itraconazole minimum inhibitory concentration for Fonsecaea pedrosoi using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and chemometrics

Fonsecaea pedrosoi is one of the main agents of chromoblastomycosis, a chronic subcutaneous mycosis. Itraconazole (ITC) is the most used antifungal in its treatment, however, in vitro antifungal susceptibility tests are important to define the best therapy. These tests are standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), but these protocols have limitations such as the high complexity, cost and time to conduct. An alternative to in vitro susceptibility test, which overcomes these limitations, is FTIR. This study determined the minimum inhibitory concentration (MIC) of itraconazole for F. pedrosoi, using FTIR and chemometrics. The susceptibility to ITC of 36 strains of F. pedrosoi was determined according to CLSI and with the addition of tricyclazole (TCZ), to inhibit 1,8-dihydroxynaphthalene (DHN)-melanin biosynthesis. Strains were grown in Sabouraud agar and prepared for Attenuated Total Reflection (ATR)/FTIR. Partial least squares (PLS) regression was performed using leave-one-out cross-validation (by steps of quintuplicates), then tested on an external validation set. A coefficient of determination (R²) higher than 0.99 was obtained for both the MIC-ITC and MIC-ITC+TCZ ATR/PLS models, confirming a high correlation of the reference values with the ones predicted using the FTIR spectra. This is the first study to propose the use of FTIR and chemometric analyses according to the M38-A2 CLSI protocol to predict ITC MICs of F. pedrosoi. Considering the limitations of the conventional methods to test in vitro susceptibility, this is a promising methodology to be used for other microorganisms and drugs

Discrimination of healthy and colorectal cancer patients using FTIR and PLS-DA

Spectroscopic methods have already been used as effective tools in several studies involving the detection of cancer. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) has already been applied in the discrimination of cancer cells and tissues or blood of patients with the disease, observing that this technique requires the use of chemometric algorithms to obtain such results. The aim of this study was to employ a partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) with FTIR data in the discrimination of plasma samples from patients with colorectal cancer (RCC) and healthy individuals. Multivariate analysis was performed using PLS-DA of the sample triplicates (n=90) with different types of processing. The best PLS-DA condition was obtained using the 1st derivative, 1 orthogonal signal correction (OSC) and no pre-processing. With 1 factor only, the model presented a mean square error of cross-validation (RMSECV) of 0.0004 and coefficient of determination (r^2) of 1.0000. The accuracy, precision and sensitivity of the model were 100%

Síntese e avaliação de azoderivado de 2-fenilbenzoxazol como substrato fluorogênico na diferenciação de Candida spp.

Neste estudo foram sintetizados três derivados de 2-fenilbenzoxazol (2FBO) funcionalizados com a função azo: (2’-hidroxi-5’-fenilazofenil)benzoxazol (HFAZBO), 2-(2’-hidroxi-5’-(4’’-carboxi)fenilazofenil)benzoxazol (HFAZBO-CO2H) e 2-(2’-hidroxi-5’-(4’’-nitro)fenilazofenil)benzoxazol (HFAZBO-NO2).Os compostos foram utilizados como substratos fluorogênicos para agentes de infecção urinária, representantes de Candida spp., para explorar suas características metabólicas. A caracterização estrutural dos compostos foi realizada por meio de Espectroscopia de Absorção Molecular no Infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e por determinação da faixa de fusão. Os ensaios fluorogênicos foram realizados em espécies de Candida spp.: Candida albicans ATCC 10231, Candida famata RL38, Candida glabrata 06130L, Candida glabrata RL43, Candida glabrata 0030L, Candida guilliermondii TH07, Candida krusei ATCC 6258, Candida krusei 0037L, Candida parapsilosis (RL33), Candida parapsilosis (RL38), Candida stellatoidea (9875), Candida stellatoidea (3613), Candida tropicalis ATCC 750. Não foi observada alteração sob luz uv nas leveduras testadas. Do mesmo modo, o extrato obtido a partir das colônias não apresentou fluorescência sob luz uv. Dessa forma, faz-se necessário desenvolver novos estudos que avaliem a função metabólica de Candida spp. a partir da biotransformação levando a liberação de moléculas fluorescentes

AVALIAÇÃO DE FONTES DE CARBONO PARA A PRODUÇÃO DE INIBIDOR DE CRESCIMENTO DE Aspergillus fumigatus USP2 por Corynebacterium sp.

O aumento significativo na incidência de infecções fúngicas invasivas e a resistência natural de agentes etiológicos a antifúngicos existentes têm motivado a constante pesquisa por novos agentes antifúngicos nos ultimos anos. Neste sentido, foi selcionada uma cepa de Corynebacterium sp. com potencial antagonista frente à Aspergilus fumigatus USP2. A cepa foi cultivada em fase submersa e em fase sólida, avaliando-se a variação das fontes de glicose, sacarose e glicerol em presença de peptona, bem como o meio sintético Czapek. Os caldos de cultivo submerso foram utilizados para o ensaio de antagonismo microbiano com o fungo Aspergillus fumigatus USP2. Os resultados apontam que o cultivo em fase sólida utilizando glicose como fonte de carbono apresenta maior potencial inibitório da cepa de Corynebacterium sp. sobre o fungo Aspergillus fumigatus USP2

Effect of steroid hormones on the in vitro antifungal activity of itraconazole on Fonsecaea pedrosoi

The in vitro antifungal activity of itraconazole, combined with oestradiol, testosterone or progesterone, on the growth of Fonsecaea pedrosoi was evaluated.   Fonsecaea pedrosoi was cultured in Sabouraud supplemented with dimethyl sulphoxide dilutions in β-oestradiol (0.04 μg/mL and 0.04 mg/mL), progesterone (0.06 μg/mL and 0.06 mg/mL) or testosterone (1.2 μg/mL and 1.2 mg/mL) combined with 0.01 to 1 μg/mL of itraconazole. The sex steroid hormones did not modify the growth pattern of F. pedrosoi when they were in the presence itraconazole. The absence of synergistic or antagonistic activity of oestradiol, progesterone, testosterone and itraconazole on the growth of F. pedrosoi observed in this work does not rule out in vivo factors related to the development of the disease and to the success of an antifungal treatment.A atividade antifúngica in vitro de itraconazol, combinada com estradiol, testosterona ou progesterona no crescimento de Fonsecaea pedrosoi foi avaliada.  F. pedrosoi foi cultivado em Sabouraud suplementado com β-estradiol (0,04 μg/mL e 0,04 mg/mL), progesterona (0,06 μg/mL e 0,06 mg/mL) ou testosterona (1,2 μg/mL e 1,2 mg/mL) combinados com itraconazol diluído em dimetilsulfóxido na faixa de concentração entre 0,01 e 1 μg/mL. Os hormônios esteróides sexuais não modificaram a inibição de F. pedrosoi pelo itraconazol. A ausência da atividade de sinergismo ou antagonismo de estradiol, progesterona, testosterona e itraconazol no crescimento de F. pedrosoi observada neste trabalho não exclui fatores in vivo relacionados ao desenvolvimento da doença e para o sucesso de um tratamento antifúngico

Efeito de hormônios esteróides na atividade antifúngica in vitro de itraconazol em Fonsecaea pedrosoi

The in vitro antifungal activity of itraconazole, combined with oestradiol, testosterone or progesterone, on the growth of Fonsecaea pedrosoi was evaluated. Fonsecaea pedrosoi was cultured in Sabouraud supplemented with dimethyl sulphoxide dilutions in β-oestradiol (0.04 μg/mL and 0.04 mg/mL), progesterone (0.06 μg/mL and 0.06 mg/mL) or testosterone (1.2 μg/mL and 1.2 mg/ mL) combined with 0.01 to 1 μg/mL of itraconazole. The sex steroid hormones did not modify the growth pattern of F. pedrosoi when they were in the presence itraconazole. The absence of synergistic or antagonistic activity of oestradiol, progesterone, testosterone and itraconazole on the growth of F. pedrosoi observed in this work does not rule out in vivo factors related to the development of the disease and to the success of an antifungal treatment.A atividade antifúngica in vitro de itraconazol, combinada com estradiol, testosterona ou progesterona no crescimento de Fonsecaea pedrosoi foi avaliada. F. pedrosoi foi cultivado em Sabouraud suplementado com β-estradiol (0,04 μg/mL e 0,04 mg/mL), progesterona (0,06 μg/mL e 0,06 mg/mL) ou testosterona (1,2 μg/mL e 1,2 mg/mL) combinados com itraconazol diluído em dimetilsulfóxido na faixa de concentração entre 0,01 e 1 μg/mL. Os hormônios esteróides sexuais não modificaram a inibição de F. pedrosoi pelo itraconazol. A ausência da atividade de sinergismo ou antagonismo de estradiol, progesterona, testosterona e itraconazol no crescimento de F. pedrosoi observada neste trabalho não exclui fatores in vivo relacionados ao desenvolvimento da doença e para o sucesso de um tratamento antifúngico

Secreção de cinco enzimas extracelulares por amostras de agentes da cromoblastomicose

The gelatinase, urease, lipase, phospholipase and DNase activities of 11 chromoblastomycosis agents constituted by strains of Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii, Cladophialophora bantiana and Exophiala jeanselmei were analyzed and compared. All strains presented urease, gelatinase and lipase activity. Phospholipase activity was detected only on five of six strains of F. pedrosoi. DNase activity was not detected on the strains studied. Our results indicate that only phospholipase production, induced by egg yolk substrate, was useful for the differentiation of the taxonomically related species studied, based on their enzymatic profile.As atividades gelatinase, urease, lipase, fosfolipase e DNase de 11 agentes da cromoblastomicose constituídos por amostras de Fonsecaea pedrosoi, F. compacta, Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii, Cladophialophora bantiana e Exophiala jeanselmei foram analisadas e comparadas. Todas as amostras apresentaram atividade urease, gelatinase e lipase. A atividade fosfolipase foi detectada apenas em cinco das seis amostras de F. pedrosoi. A atividade DNase não foi detectada nas amostras estudadas. Os resultados indicam que para a diferenciação entre espécies taxonomicamente relacionadas estudadas, baseado no seu perfil enzimático, apenas a produção de fosfolipase, induzida pelo substrato com gema de ovo, foi útil

Comparision of lipolytic activity of Sporothrix schenckii strains utilizing olive oil-rhodamine B and tween 80

The aim of this work was to identify the lipase activity of Sporothrix schenckii strains using Rhodamine B as an indicator of triglyceride hydrolysis (triolein from olive oil) and to compare these results with the use of Tween 80 as substrate. Free fatty acids released from lipase activity were detected on agar plate complexed with Rhodamine B, when exposed to UVA light, through orange fluorescence and by precipitation haloes on Tween 80 agar. There were differences in lipolytic activity among strains and between the media utilized. The highest lipase activity (orange fluorescence) was observed on the biomass of 10 strains, with no fluorescent haloes around the colonies, whereas only six strains showed large precipitation haloes. These plate assays are suitable for the detection of lipase-producing strains of S. schenckii in the yeast phase, but it is still unknown whether different enzymes act upon the substrates or whether there are variations of the same enzyme with different specificities